虽然beta-CoV,尤其本次的SARS-CoV-2,给全球人类的健康造成严重威胁,但alpha-CoV也是不容忽视的一种传播感冒样症状相关的主要病毒,在极少数情况下会导致严重的呼吸系统衰竭。HCoV-NL63为alpha-CoV中一种带有膜包被的病毒,在自然界中广泛存在。据统计,每年引起呼吸道疾病的病原体中约有10%为HCoV-NL63。与SAR2-CoV和SARS-CoV-2一样,HCoV-NL63也是以血管紧张素转化酶2(ACE2)为受体感染人体。HCoV-NL63利用从病毒囊膜突出的刺突糖蛋白(S)三聚体与ACE2结合,进而介导病毒与人体融合。
病毒表面的S蛋白是中和抗体的主要靶标,对疫苗设计和药物结构优化研究至关重要。每个S蛋白包含两大区域:处于N末端的S1(负责与受体结合);处于C末端的S2(介导单跨膜螺旋将S蛋白固定在病毒包膜上)。一旦S蛋白的S2'位点被宿主跨膜丝氨酸蛋白酶裂解而激活,S蛋白会从融合前构象转变到融合后构象。已有研究揭秘了纯化后的融合前S蛋白胞外域的结构,其结果显示S1具有构象异质性、多个糖基化位点。
2020年8月11日,美国斯坦福大学生物工程系的研究员张凯铭、博士后李珊珊及其同事通过单颗粒冷冻电镜技术,从无化学固定剂的病毒体表面直接挑取其刺突蛋白颗粒,经过三维重构,以0.34纳米的分辨率展示了HCoV-NL63S蛋白三聚体的原位结构,并清楚的看到蛋白表面的糖基化密度(图1a-d)。这种结构为将来研究处于天然状态下的冠状病毒S蛋白与受体、抗体或药物结合研究奠定了基础。
图1 单颗粒冷冻电镜技术解析HCoV-NL63 S蛋白原位结构
与SARS-CoV-2相比,HCoV-NL63 S1区域具有一个额外的N末端结构域(结构域0),该域被认为是结构域A的基因重复且是Alpha冠状病毒的典型特征。SARS-CoV-2的结构域B(RBD)具有一定的灵活性,在向上(开放)和向下(闭合)构象之间转换,ACE2能够结合RBD的向上构象以启动病毒与受体的结合。而HCoV-NL63的结构域B与A相互作用,被稳定在HCoV-NL63 S1区域的闭合“圆圈”中(图2a)。根据PDBsum结构生物信息学分析,结构域A和B之间的界面区域约为500 Å2,涉及22个疏水相互作用(图2b)。因此,HCoV-NL63 RBD上的3个受体结合基序(RBMs)被掩埋在结构域A和B之间的界面中,防止其与ACE2的结合。已有研究显示,HCoV-NL63在结合ACE2进入病毒之前,利用硫酸乙酰肝素蛋白聚糖作为附着因子。然而,硫酸乙酰肝素与HCoV-NL63 S1的结合是否诱导S1区域构象变化以释放RBMs,从而与ACE2结合尚须进一步研究。
冠状病毒的S蛋白需要裂解蛋白酶才能释放融合肽,进而启动病毒囊膜与宿主膜的融合。研究人员将HCoV-NL63和SARS-CoV-2 S2的结构叠加在一起,观察到两者具有一定的结构一致性(图2c)。同时,研究人员也比较了两种的融合机制。在这两种结构中,宿主蛋白酶裂解位点所在的S2'环几乎垂直于中央螺旋,突出于S蛋白三聚体的外围,易被宿主蛋白酶接近。HCoV-NL63和SARS-CoV-2的融合机制几乎相同,只是HCoV-NL63的S2'触发环在回环以连接至融合肽之前形成一个短的alpha-螺旋,而SARS-CoV-2会形成一个长而灵活的回环。
图2 HCoV-NL63和SARS-CoV-2 S蛋白结构比较